بررسي ميزان آدنوزين تري فسفات در اسپرم مولدين ماهي كفال طلائي در شرايط مختلف

چکیده:

کفال ماهیان دریای خزر یکی از مهمترین ماهیان شیلا تی این دریا می باشند که امروزه اکثریت صید ماهیان دریای مذکور به خود اختصاص داده اند.:  هدف از این تحقیق بررسی میزان ATP اسپرم ماهی کفال طلایی[1] در شرایط زمانی، دمایی و تداوم بخش[2]های مختلف بوده است.:  بدین منظور میزان ATP اسپرم های:

1) نمونه های تازه در دماهای مختلف 10-12 درجه و 18-20 درجه سانتی گراد،

2) نمونه های نگهداری شده در دماهای مختلف4 (درجه و دمای اتاق) به مدت شش ساعت،

3) نمونه های نگهداری شده در ( تداوم بخش های مختلف ( گلیسرول، محلول نمک 7/0 %، محلول نمک  65/0%)  به مدت 5 و 10 روز، به روش فوق حساس بیو- لومینوسانس اندازه گیری گردید.

  بر اساس آزمایش های انجام شده در این تحقیق غلظت ATP اسپرم های تازه نمونه گیری شده در دمای 10 تا 12 درجه سانتیگراد 22/7 ±04/74%  غلظت ATP اسپرم های تازه نمونه گیری شده در دمای 18 تا 20 درجه بود. اسپرم های نگهداری شده در دمای 4 درجه و دمای آزمایشگاه به مدت 6 ساعت به ترتیب   91/0 ±26/90%   و 49/1 ±17/17%  ATP  خود را حفظ کردند.

نگهداری اسپرم در تداوم بخش های مختلف( گلیسرول، محلول نمک 7/0 %، محلول نمک 65/0% ) به مدت  5 روز نشان داد که گلیسرول و محلول نمک 65/0% درصد بالاتری از ATP را نسبت به محلول نمک 7/0% حفظ کردند و نگهداری اسپرم در همان تداوم بخش ها به مدت 10 روز نشان داد که گلیسرول درصد بالاتری از ATP را نسبت به محلول نمک 7/0% و 65/0% حفظ کرد.

 براساس نتایج بدست آمده برای حفظ میزان ATP اسپرم ماهی كفال طلایی  نمونه گیری در دمای 18-20 درجه و نگهداری در گلیسرول توصیه می شود.



واژگان کلیدی: اسپرم، ماهی کفال طلایی، ATP،




مقدمه:

اسپرم به عنوان یک عامل مهم تولید مثل، بقاء و تداوم نسل است. بررسی اسپرم از نظر پارامترهایی چون توانایی تلقیح، تحرک، درصد اسپرم های متحرک، سرعت حرکت، فرکانس ضربه تاژکی، میزان  ATP و فاکتورهای شیمیایی و بیو شیمیایی، در تشخیص کیفیت اسپرم و کنترل روند تولید مثلی موجودات زنده از جمله آبزیان به ما کمک می کند. به همین علت تاکنون تحقیقات گسترده ایی توسط پژوهشگران مختلف روی این سلول صورت گرفته است. با این حال مطالعات انجام شده در ارتباط با میزان ATP  اسپرم ماهیان نسبتا کم است. این امر تفسیر علت ناموفق بودن پروژه های پرورشی کردن برخی ماهیان را دشوار می کند. در این رابطه باید مطالعات بیشتری در زمینه بررسی میزان           ATP اسپرم ماهیان صورت پذیرد. اسپرم به کمک حرکت ضربه ایی تاژک خود شنا می کند. انرژی مورد نیاز برای این حرکت از طریق هیدرولیزATP  فراهم می شود.(1).تحرک اسپرم به میزان ATP ذخیره ایی اولیه(2)  و میزان  ATP سنتز شده در طول فاز تحرک (3) وابسته است. در اکثر ماهیانی که دارای لقاح خارجی هستند،ATP  سنتاز قادر به نگهداری نسبت های بالای ATP  هیدرولیز شده مورد نیاز در طول حرکت نیست لذا میزان  ATP به سرعت کاهش می یابد. این کاهش ATP  به موازات کاهش تعداد ضربات تاژکی و سرعت حرکت اسپرم است(2).  یك رابطه خطی بین ظرفیت تلقیح اسپرم و پارامترهای اسپرمی از جمله میزان ATP  و سرعت حركت اسپرم وجود دارد(4) آنزیم اصلی تبدیل انرژی شیمیایی گرادیان پروتون در سیستم بیولوژیكی ، ATP سنتتاز است. این آنزیم برای سنتز ATP از ADP و فسفات غیرآلی استفاده می كند ساختمان و عملكرد این آنزیم در گونه های مختلف یكسان است (5)  تفاوت قابل توجهی بین گونه ها در مقدار ATPمورد نیاز برای تامین حرکت اسپرم وجود دارد(6). تحقیقی در رابطه با میزان ATP اسپرم ماهی کفال طلایی تاکنون صورت نگرفته است. در این پروژه سعی بر آن داشتیم که میزانATP  اسپرم ماهی کفال طلایی را در شرایط مختلف اندازه گیری نماییم.

 مواد و روشها:

به منظور بیان میزان ATP برحسب تعداد سلول ، تعداد اسپرم های موجود در یك میلی لیتر از مایع اسپرم اخذ شده از 10 ماهی نر كفال طلایی ، به كمك لام نئوبار و میكروسكوپ نوری (NIKON Y100) مورد شمارش قرار گرفت. در این تحقیق جهت بررسی تاثیر دمای نمونه گیری و میزان ATP اسپرم ماهی ، نمونه گیری در دو دمای  ?C 10-12 و18-20 ?C  انجام شد . ما در این تحقیق برای اندازه گیری میزان ATP از روش بیولومینوسانس استفاده کردیم بدین شکل که نمونه اسپرم را به نسبت 100/1 در محلول بافر HEPES جوشان مخلوط کرده  سپس 50 از آن را با  50 از محلول کیت حساس بیولومینو سانس (Biaffin) در پلیت مخصوص اندازه گیری لومینوسانس با هم مخلوط کرده و سینگالهای لومینوسانس را با استفاده از دستگاه لومینومتر
 10-19 mol/well, Germany) × (Lumistar ,BMG labtech GmbH, 5اندازه گیری کرده و سپس میزان ATP هرنمونه را با استفاده از استانداردهای ATP محاسبه کرده  و بصورت nmol/108  اسپرم بیان کردیم.

 درجه حرارت نگهداری اسپرم ها بر میزان ATP سلول های مذكور تاثیرگذار خواهد بود. لذا جهت بررسی دمای مناسب نگهداری ، اسپرم ها به مدت 6 ساعت در دمای  4 درجه و دمای آزمایشگاه نگهداری و سپس میزان ATP آن ها مورد اندازه گیری قرار گرفت. معمولا برای نگهداری اسپرم از محلول های تداوم بخشExtenders )) استفاده می كنند این محلول ها سبب تداوم و حفظ فعالیت اسپرم ها در دوره نگهداری می شوند. به منظور بررسی بهترین محلول تداوم بخش ، محلول گلیسرول 10 درصد و گلوكز 0.3 مولار ، محلول نمك 0.7 درصد و محلول نمك 0.65 درصد مورد بررسی قرار گرفتند . میزان ATP اسپرم ها در محلول های مذكور پس از نگهداری اسپرم در دمای منفی 15 درجه در زمان های 5 و 10 روز مورد سنجش قرار گرفت.

جهت انجام تحقیق در روز دهم آبان  1384از دریاچه خزر که دمای آب آن  18 تا 20?C و شوری آن  12 تا  13 ppm بود و همچنین در روز  17 آبان  1384 در پی کولاک و کاهش چشمگیردمای هوا از دریاچه خزرکه دمای آب آن 10  تا 12 ?C و شوری آن  12 تا ppm 13

بحث و نتیجه گیری

تحقیقات زیادی در ارتباط با اسپرم ماهی در جهان صورت گرفته است که هر کدام جنبه خاصی را مد نظر قرار داده است. محدودیت ها و مشكلات و عوامل موجب خطا به صورت زیر است : یكی از مشكلات و محدودیت های این پروژه، محدودیت زمانی بود زیرا این پروژه باید در طول فصل تولید مثل ماهی كفال طلایی كه دو ماه می باشد انجام می شد هم چنین به علت بروز مشكلات غیرمترقبه در زمان انجام این پروژه ، به اواسط فصل تولیدمثل نزدیك شده در نتیجه اندازه گیری میزان ATP اسپرم ماهی كفال طلایی در دوره های  نگهداری كوتاه مدت 5 و 10 روزه انجام شد كه در صورت عدم وجود این محدودیت های زمانی ، اندازه گیری میزان ATP اسپرم درحا اطلاعات محدودی در مورد میزان ATP اسپرم ماهی و اثرات فاکتورهای محیطی و شیمیایی و بیوشیمیایی بر آن وجود دارد.

طبق گزارشات Perchec و همکارانش(10 ) در صورت آلوده نشدن اسپرم به ادرار، میزان ATP آن حدود اسپرم  و در صورت آلوده شدن به ادرار، میزان ATP آن حدود اسپرم بود. برای اندازه گیری غلظت ATP، لوسیفرین – لوسیفر از ( حل شده در 100mM  گلایسین، 20mM   Mgso4، PH7/4) را به نمونه افزوده وسیگنالهای بیولومینوسانس را با استفاده از  یک دستگاه
لومینومتر Lmax ، 96 چاهکی (Molecular, Devices Sunngvale,CA,USA) اندازه گیری می كنند و میزان ATP  هر نمونه را با استفاده از استانداردهای ATP محاسبه می كنند
و بصورت Pmol/108 اسپرم بیان می شود.Ogier وهمکارانش(11)
میزان ATP را با استفاده از روش بیولومینوسانس(اندازه گیری بیولومینوسانس
Kit ClsII, ATP ،Boehringer-Mannheim ) ، پس از استخراج با یک تری کلرواستیک اسید2%  ، mM2 EDTA، اندازه گیری کردند و بصورت nmol/108 اسپرم بیان کردند. Perchec و همکارانش (10) میزان ATP را بوسیله روش بیولومینوسانس اندازه گیری کردند به این شکل که اسپرم ماهی کپور معمولی را به نسبت 100/1 در بافر HEPES جوشان تجزیه کرده و سپس با افزودن لوسیفرین – لوسیفراز به اسپرم، سیگنالهای لومینوسانس را به وسیله (Biocounter M2010A Lumac/3M) اندازه گیری کردند و سپس میزان ATP را با استفاده از استانداردهای ATP محاسبه کردن و بصورت nmol/108  اسپرم بیان کرده اند. در مورد تلقیح مصنوعی گاهی نگهداری اسپرم لازم است . مدت زمان تحرک اسپرم نیز متاثر از دمای نگهداری است بطوریکه طبق گزارشات 12)) نگهداری کوتاه مدت (15 دقیقه) اسپرم در دمای ?C 20، مدت زمان تحرکش را کاهش می دهد، آنها همچنین مشاهده کردند که میزان تحرک اسپرم کپور ماهی معمولی پس از 2 ساعت نگهداری در دمای ?C  20 حدود 50% کاهش یافت. نتایج تحقیق این دو همکار نشان داد که امکان نگهداری اسپرم در یخچال (?C  5 ) تا 24 ساعت برای ماهی کپور معمولی و تا 8 ساعت برای ماهی کپور علفخوار بدون کاهش قابل توجه کیفیت اسپرم وجود دارد. در مورد ماهی قزل آلا Oncorhynchus mykiss ، گزارش شده است که سطح ATP و میزان حرکت اسپرم این نوع ماهی بعد از ذوب بطور قابل توجهی کاهش می یابد. ولی Ogier و همکارانش گزارش کردند که اسپرم گربه ماهی اروپایی بدون کاهش سطح ATP خیلی متفاوت عمل می کنند. اسپرم منجمد شده گربه ماهی اروپایی با DMA موجب افزایش قابل توجه سطح ATP اسپرم می شود که این بدین علت است که DMA موجب تحریک مستقیم سنتز ATP می شود که این افزایش سطح ATP در طول فرآیند، احتمالاً یک عامل مهم در تحمل انجماد اسپرم گربه ماهی اروپایی در حالت وجود DMA باشد. ولی نتایج کسب شده از آزمایشات به ما نشان داد که در این تحقیق بهترین تداوم بخش گلیسرول 10% و گلوکز 3M/0  است. ضمنا تحقیق مشابهی در این رابطه یافت نشده است.